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Da diversi anni il laboratorio collabora con la casa farmaceutica Bracco Spa per indagare i meccanismi di trasporto che regolano l'eliminazione biliare di alcuni mezzi di contrasto per MRI.

Gli studi finora condotti hanno dimostrato che alcuni agenti di contrasto già uso in clinica o in fasi di sperimentazione avanzata sono substrati per il trasportatore canalicolare MRP2, che quindi appare essere il maggiore responsabile della loro eliminazione biliare (Lorusso V. et al. 2002, Biochem. Biophys. Res. Comm. 293-1:100-5).

Non è ancora del tutto chiarito, invece, quale sia il trasportatore che regola l'entrata nella cellula epatica di questi composti. Molte evidenze indirette indicano che la classe dei mezzi di contrasto costituita da complessi del gadolinio e con struttura chimica derivata dal DTPA (acido dietilene-triamino-pentacetico) è substrato per una famiglia di trasportatori conosciuta come OATP (organic anion transporting polipeptide). Non esistono per ora dimostrazioni conclusive su quale proteina della famiglia sia effettivamente coinvolta e tanto meno il significato farmacologico di tale trasporto. Dalle sperimentazioni in corso si deduce che sono molti i trasportatori della famiglia OATP (e forse non solo) che possono rispondere dell'accumulo epatico dei complessi del gadolinio.

Recentemente è stato messo a punto un sistema di valutazione quantitativa assoluta per espressione genica a livello di RNA di 13 trasportatori umani passivi (o secondariamente attivi) per anioni organici, cationi e piccoli peptidi. Detti trasportatori sono: OATP-A, OATP-B, OATP-C, OATP-D, OATP-8, OATP-D, OATP-E, NTCP, OAT2, OAT3, OCT1, PEPT1, PEPT2.

Questi trasportatori, scelti per la loro importanza a livello epatico, risultano espressi anche in altri tessuti, soprattutto quelli coinvolti nel metabolismo e detossificazione dei farmaci. Sono, infatti, quelli principalmente coinvolti nell'accumulo cellulare della maggior parte dei farmaci di uso comune (Lorusso V. et al. 2005, Curr Pharm Des, review in press), fatta eccezione per le molecole che raggiungono i trasportatori per nutrienti, nucleotidi e canali vari.

Il sistema di valutazione usato si basa su analisi in RT-PCR quantitativa che diventa assoluta grazie all'utilizzo di curve di taratura costruite con amplificati specifici inseriti in plasmidi. Ad oggi, l'espressione dei 13 trasportatori è stata indagata in cellule epatiche in linea (Chang liver e HepG2) e un campione di fegato normale. L'analisi ha validato l'ipotesi dell'intervento di proteine OATP nel trasporto epatico del mezzo di contrasto B22956, dimostrando oltretutto una grossa affinità da parte del trasportatore OATP-8 (Libra A. et al. 2005, FEBS Journal 272 (s1): abstract C3-045P).

Questa proteina viene definita epatospecifica per la sua presenza quasi esclusiva nel fegato sano, mentre è interessante da un punto di vista diagnostico che esso sia quasi assente in corso di carcinoma epatico.

L'importanza di valutare l'espressione dei suddetti trasportatori risiede nel fatto che ciò consente una migliore interpretazione dei possibili studi di trasporto e biodisponibilità per le molecole di interesse, oltre che guidare studi di drug targeting per tessuti sani e patologici.

Ci si propone di utilizzare il sistema sperimentale descritto per valutare la presenza e importanza dei summenzionati geni in diversi sistemi cellulari ed estratti di tessuti umani, quali cellule intestinali (Caco2, HT29), cellule renali (podociti e cellule tubulari), tessuti patologici ed altri modelli cellulari.

Un altro aspetto della ricerca sui mezzi di contrasto per MRI è quello di indagare il destino intracellulare di queste molecole, per evidenziare eventuali distretti che possano interferire o incrementare le rilevazioni del segnale imaging. E' in preparazione un anticorpo policlonale capace diriconoscere la molecola di Gd-DTPA, e di conseguenza la maggior parte dei mezzi di contrasto derivati da questo nucleon. L'utilizzo della molecola consentirà diverse analisi in vitro atte ad indagare il metabolismo cellulare e tessutale di questi composti.

Allo stesso scopo saranno condotte anche indagini in microscopia in fluorescenza da raggi X, che saranno in collaborazione con il gruppo LILLIT-TASC del Sincrotrone Elettra.

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Nelle patologie a carico dell'ileo terminale esiste il rischio elevato di comparsa di litiasi biliari i cui meccanismi fisiopatologici sono ancora sconosciuti. In generale, i calcoli biliari sono costituiti da colesterolo, bilirubinati di calcio o altri sali di calcio. Una maggior abbondanza di calcoli pigmentati (bilirubinati) si registra nelle patologie dell'ileo e soprattutto in seguito a resezione o by-pass dello stesso. La bilirubina, che viene prodotta a livello del sistema reticolo endoteliale, viene normalmente metabolizzata dal fegato che provvede a coniugarla con acido glucuronico, per poi trasferirla, sotto questa forma, nella via biliare. Mentre la maggior parte viene escreta con le feci, una certa quota di bilirubina viene deconiugata nel colon ad opera della flora intestinale e riassorbita per ritornare al fegato.

In corso di patologia ileale la composizione della bile e lo stato della flora batterica risultano alterati. E' obbiettivo della nostra indagine far luce sui meccanismi che regolano il circolo enteroepatico della bilirubina non coniugata in queste particolari condizioni patologiche, con l'ipotesi che un variato/aumentato riassorbimento della bilirubina possa essere alla base della formazione di calcoli pigmentati nelle patologie dell'ileo. A questo scopo verranno condotti degli esperimenti in modelli animali con resezione ileale e studi su linee cellulari (es.Caco2), derivate da colon. In tali cellule si verificherà l'eventuale presenza di meccanismi di diffusione, meccanismi carrier mediati passivi o attivi. In fase finale si cercherà di associare i livelli di espressione dei trasportatori per bilirubina e/o acidi biliari ad un normale o alterato circolo enteroepatico della bilirubina non coniugata.

Dalle indagini ci si aspetta di dimostrare che in assenza di un ileo funzionale il riassorbimento di bilirubina non coniugata è maggiore, come variamente ipotizzato in altri studi (Mendez-Sanchez N. et al. 2001 Eur J Clin Invest 31(9):773-80). L'ipotesi è che, per la presenza di acidi biliari nel colon o/e per l'alterato tempo di transito intestinale dei componenti della bile, la bilirubina venga maggiormente deconiugata e quindi riassorbita dall'epitelio del colon. Un tale aumentato ricircolo sarebbe all'origine delle litiasi pigmentate associate a patologie dell'ileo.

Si potrà quindi far luce sui meccanismi molecolari coinvolti in questa, spesso trascurata, ma importante fase del metabolismo della bilirubina.

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Numerose osservazioni epidemiologiche hanno riscontrato una significativa correlazione inversa tra incidenza di malattia cardiovascolare ischemica e livelli sierici di bilirubinemia (riassunti in Rigato I et al. TTM 2005; 11:277-283). In alcuni casi, il valore di bilirubinemia è addirittura identificabile come fattore di rischio indipendente di malattia (Hopkins PN. Arterioscler Thromb Vasc. 1996; 16: 250). Analoghe osservazioni sono state documentate nella prevalenza della malattia vascolare periferica aterosclerotica (Krijgsman B.Int Angiol. 2002; 21:44).

La malattia cardiovascolare è la causa di morte e disabilità più importante nel mondo occidentale (The World Health Report 2002.)e tra le malattie cardiovascolari la malattia vascolare aterosclerotica rappresenta la proporzione maggiore.

Le lesioni aterosclerotiche si creano principalmente nelle arterie di medio e grande calibro con parete muscolare elastica e possono determinare ischemia nei tessuti a valle della lesione stessa. I principali organi che risentono maggiormente di tali effetti sono il cuore, il sistema nervoso centrale, il rene e le estremità (Ross R. NEJM. 1999; 340:115). Il primo evento che si verifica nella insorgenza di una lesione aterosclerotica è la comparsa della disfunzione endoteliale (PanzaJA, NEJM 323, 1990 – RossR NEJM 340, 1999) che determina la comparsa sull'endotelio di un aumento dell'espressione delle molecole di adesione (VCMA-1, ECAM-1) che favorirebbero l'adesione di linfo/monociti e la susseguente migrazione nell'intima.

Per disfunzione endoteliale si intende una successione di condizioni patologiche che coinvolgono l'endotelio vascolare determinate da una ridotta biodisponibilitaà del NO. Questa riduzione può essere causata da diversi meccanismi: ridotta espressione dell eNOS (endothelial NO Synthase), assenza del substrato o co-fattori per eNOS o accelerato consumo di NO da parte dei radicali liberi dell'ossigeno (ROS) (Cai H, Circ Res 2000; 87: 840).

Questo progetto di ricerca si pone come obiettivo lo studio degli eventuali effetti della bilirubina non coniugata nell'insorgenza della disfunzione endoteliale tramite l'utilizzo di modelli cellulari in vitro di alterata funzionalità endoteliale.

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Le Ferredossina NADP(H) ossidoriduttasi (FNRs EC 1.18.1.2) sono flavoenzimi distribuiti ubiquitariamente in animali, piante e procarioti, dove catalizzano il trasferimento reversibile di elettroni tra due molecole trasportatrici obbligate di elettroni (ferredossina, flavodossina) e una unica molecola di NADP(H). E' stato dimostrato che le FNRs proteggono dallo stress ossidativo in protobatteri e cianobatteri. Le isoforme trovate nelle piante sono 200-500 volte più attive di quelle animali o procariote, una proprietà che può spiegare la loro notevole capacità come antiossidanti in modelli sperimentali batterici. Le proprietà antiossidanti di FNR possono essere particolarmente importanti per evitare e controbilanciare un'alterazione dello stato redox. La flavodossina d'Anabaena è stata capace di proteggere piante di tabacco transgeniche dallo stress foto-ossidativo e dalla deprivazione d'acqua. Le flavodossine sono proteine redox che hanno come cofattore la flavina-mononucleotide e sono parte dei vari sistemi di trasporto d'elettroni come analoghi funzionali della ferredossina. Sebbene le flavodossine siano state trovate soltanto in batteri e alghe, queste proteine esibiscono similarità con domini proteici di origine procariotica e anche eucariotica. Dal momento che queste proteine hanno mostrato protezione contro lo stress ossidativo sia in batteri che in piante superiori, l'obiettivo di questo progetto è studiareil loro ruolo protettivo quando siano espresse in sistemi eucaristici quali ad esempio cellule di mammifero. Gli sperimenti sono condotti in linee cellulari derivati da Cos-7 (ECACC, No. 87021302) che esprimono FNR e flavodossina sottoposte a diversi insulti ossidativi in vitro. Dopo il trattamento vengono eseguiti vari tests di vitalità oltre ala determinazione dei parametri di ossidazione cellulare precoci e tardivi che vengono comparati con quelli delle cellule non transfetate.

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Il lavoro prevede l'indagine sui meccanismi molecolari del metabolismo della bilirubina in modelli animali, in particolare il possibile coinvolgimento nel trasporto della bilirubina da parte di alcune proteine di membrana, note per essere dei trasportatori di anioni organici. Lo studio si è concentrato in particolare sulla proteina MRP1, un trasportatore che appartiene alla superfamiglia delle ABC proteins.

Il lavoro di ricerca prevede l'induzione di un danno tossico acuto da bilirubina in ratti Gunn, un ceppo di ratti mutanti affetti da un difetto congenito della metabolizzazione della bilirubina.L'induzione di un'iperbilirubinemia nei neonati del ratto Gunn causa un danno tossico che risulta in una sindrome neurologica detta BIND (Bilirubin Induced Neurologic Disfunction) il cui aspetto più grave è il kernittero. Il kernittero può colpire i bambini neonati e porta come conseguenza ad un deficit della capacità motoria del bambino, a sordità, al ritardo mentale ed eventuale decesso. Diversi studi hanno dimostrato che il sistema nervoso centrale non viene compromesso uniformemente dall'effetto tossico della bilirubina, ma che soltanto alcune aree cerebrali vengono distrutte. Il danno tossico è particolarmente evidente nei nuclei della base, nel collicolo inferiore, nei nuclei del cervelletto e nell'ipocampo.Il fatto che alcune aree cerebrali vengano compromesse, mentre le altre rimangano intatte indica che esiste una diversa espressione delle proteine di trasporto della bilirubina. L'obiettivo dello studio sarà di valutare l'espressione di MRP1 e/o di altri trasportatori di membrana in diverse aree cerebrali del ratto Gunn e valutare il ruolo protettivo di questi trasportatori nei confronti dei neuroni.

La seconda parte dello studio ha come obiettivo seguire l'evoluzione del danno neurologico da bilirubina "in vivo" tramite la tecnica dell'immaging a risonanza magnetica (MRI). La tecnica dell'MRI è stata usata come metodo di diagnosi di kernittero nell'uomo ma le immagini ottenute sono tutte a malattia già conclamata. Fino ad ora non è stata seguita l'evoluzione del kernittero tramite MRI dalla fase asintomatica alla malattia conclamata, come anche la correlazione tra un'induzione di una bilirubinemia acuta e la compromissione delle strutture cerebrali visualizzabile in MRI. Sarà indotto uno stimolo di danno neurologico nei neonati di ratti Gunn tramite l'induzione acuta di una iperbilirubinemia, dopodiché sanno visualizzate e studiate le strutture cerebrali colpite tramite l'apparecchio MRI di 7 Tesla adattato per il ratto e topo della Bracco Imaging a Ivrea.

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